Contenu
- Détection par changement de couleur
- Utiliser un lecteur ELISA pour la mesure
- ELISA en compétition directe (cytochrome c)
- Incuber l'anticorps primaire dans des tubes
Le test ELISA est un dosage immuno-enzymatique qui utilise des anticorps ou des antigènes couplés à une enzyme spécifique pour aider à déterminer la concentration en anticorps ou en antigène. Si vous prenez un test ELISA et que vous ne pouvez pas utiliser d'anticorps spécifiques pour obtenir vos résultats, un test ELISA compétitif est suggéré car il utilise un antigène conjugué à une enzyme au lieu de l'anticorps et une méthode de détection différente.
Détection par changement de couleur
Un protocole courant pour le test ELISA compétitif consiste à utiliser un anticorps primaire purifié et non marqué. L'anticorps recouvre les puits d'une plaque de microtitration et est incubé avec des standards inconnus. Un immunogène est ensuite ajouté pour se conjuguer à l'anticorps primaire, qui se liera aux sites d'anticorps qui ne sont pas encore occupés. Un substrat est ensuite utilisé pour créer un changement de couleur afin de mesurer la concentration de liaison.
Utiliser un lecteur ELISA pour la mesure
Utilisez une plaque de polystyrène microtitre et ajoutez l'anticorps primaire dans chaque puits. Pour obtenir la liaison maximale, remplissez le puits avec un microgramme d'anticorps. Incuber la plaque pendant quatre heures à température ambiante. Ajouter l'anticorps de capture primaire et laver les puits avec du PBS (sérum physiologique tamponné au phosphate). Incuber les plaques avec le tampon de blocage pendant deux heures à température ambiante. Laver deux fois les puits avec du PBS et ajouter les étalons. Placer la solution d'antigène-conjugué dans les puits et incuber à nouveau pendant deux heures. Laver à nouveau la plaque avec du PBS quatre fois. Ajoutez le substrat et mesurez les densités à la longueur d'onde spécifique à l'aide d'un lecteur ELISA.
ELISA en compétition directe (cytochrome c)
Pour un test ELISA de compétition directe, une analyse de dilution du sérum de l'antigène que vous utilisez dans l'expérience doit être effectuée. La plaque de microtitration est ensuite recouverte de cytochrome c et incubée pendant une nuit. La partie ELISA du test est ensuite effectuée par addition de réactif de blocage et d'anticorps secondaire. Les résultats d'absorbance sont lus avec un lecteur de microplaque.
Incuber l'anticorps primaire dans des tubes
Dans cette procédure, l'anticorps primaire est incubé dans des éprouvettes dans lesquelles l'antigène d'intérêt se lie à lui. Les échantillons sont ensuite ajoutés aux puits des plaques de microtitration et incubés. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer tous les complexes antigène-anticorps non liés, puis la solution de blocage est ajoutée pour empêcher le second anticorps de se lier aux puits. L'anticorps secondaire est ensuite lu sur un lecteur de plaque pour obtenir les résultats.